Attività svolta nell’ambito del progetto EJPRD-Epi4FSHD
Attività svolta nell’ambito del progetto EJPRD-Epi4FSHD
L’FSHD è una tra le più comuni forme di distrofia muscolare le cui basi genetiche si fondano sull’espressione aberrante del gene DUX4. Lo studio EJPRD-Epi4FSHD “Safety and efficacy of a possible epigenetic therapy for FSHD muscular dystrophy” si pone come obbiettivo, quello di valutare I’efficacia di WDRS per ridurre I’espressione di DUX4 e dei suoi geni target sui mioblasti isolati da pazienti FSHD e da controlli sani eseguendo studi in vitro. ll ruolo fondamentale nell’attivazione dell’espressione di DUX4 nella distrofia facio-scapolo-omerale è stato identificato dal gruppo di ricerca di “Genetica e biologia cellulare” dell’istituto San Raffaele di Milano da cui nasce I’opportunità di valutare l’utilizzo a scopo terapeutico di inibitori farmacologici e genetici di questo fattore. Sulla base dei dati preliminari, l’ipotesi principale è che i targeting di WDR5 potrebbero proteggere dalla tossicità indotta da DUX4, prevenendo l’attivazione trascrizionale di DUX4 e dei suoi geni bersaglio. Pertanto, l’obiettivo è stato quello di valutare l’efficacia di WDR5i nel ridurre l’espressione di DUX4 e dei suoi geni bersaglio su cellule muscolari FSHD e su cellule muscolari sane, mediante studi in vitro.
A tal fine, il nostro gruppo ha selezionato cinque coppie di soggetti, che rispettavano i criteri di inclusione del progetto, composte dal paziente e dal relativo parente sano, le quali sono state sottoposte al prelievo di biopsia muscolare. Le biopsie muscolari sono state utilizzate per stabilire colture di cellule muscolari primarie. Il protocollo per l’isolamento di colture primarie di mioblasti a partire da campioni di muscolo fresco è stato testato e condiviso con il gruppo di ricerca dell’Istituto San Raffaele. Abbiamo utilizzato un protocollo standard messo a punto dal Fields Center for FSHD del quale ne è riconosciuta l’attendibilità e l’efficacia e prevede una serie di passaggi che includono: la digestione enzimatica e meccanica delle biopsie muscolari; la piastratura e l’isolamento delle cellule di interesse, nello specifico i mioblasti, eseguito attraverso una fase di pre-plating ovvero una parziale eliminazione di fibroblasti; l’aggiunta di fattori di crescita e di terreni addizionali. Le cellule di interesse, ovvero le cellule satelliti, sono state isolate dalla popolazione cellulare eterogenea, attraverso l’utilizzo di biglie magnetiche coniugate con l’anticorpo anti CD56. Si tratta infatti di un marcatore di superficie espresso dai mioblasti. Questo ha consentito di ottenere una coltura pura di mioblasti, ed escludere da essa la totalità dei fibroblasti che al contrario non esprimono DC-56. I mioblasti di ciascun donatore, mantenuti in terreno appropriato, sono stati inviati al laboratorio del Dott. Davide Gabellini, IRCCS Ospedale San Raffaele, Divisione di Genetica e Biologia Cellulare, dove verranno eseguite le analisi future. I mioblasti, infatti, saranno trattate con 11 diverse concentrazioni di WDR5i comprese tra 10 e 1000 nM. L’espressione di DUX4 e dei suoi geni bersaglio sarà monitorata tramite RT-qPCR per determinare la concentrazione di WDR5i in grado di ridurre l’espressione di DUX4 e dei suoi bersagli di almeno il 50%. Successivamente verrà determinato il tempo di esposizione necessario per ottenere la risposta massima. A tal proposito, le cellule muscolari FSHD saranno trattate con WDR5i per diversi tempi fino a 72 ore.
Questo progetto apre l’orizzonte a prospettive future, infatti, le colture di mioblasti FSHD possono essere utilizzate allo scopo valutare i meccanismi del sistema immunitario innato e dell’attivazione del complemento nei modelli cellulari, tramite:
- Generazione di modelli in vitro per replicare i cambiamenti del sistema immunitario innato e del complemento nella patogenesi della FSHD;
- Esecuzione di analisi in vitro della risposta dei macrofagi e dell’attivazione del complemento verso i mioblasti che esprimono DUX4
